Anna Honzáková wurde 1875 in Kopidlno, in Nordböhmen, als fünftes von sechs Kindern in eine Ärztefamilie geboren. Nach dem frühen Tod des Vaters zog die Familie in den Prager Stadtteil Vinohrady. Anna Honzáková besuchte dort das 1890 von u.a. Eliška Krásnohorská gegründete Mädchengymnasium „Minerva“.

Nachdem sie 1895 die Matura absolviert hatte, wollte sie wie ihr älterer Bruder Medizin studieren, wurde jedoch nur als außerordentliche Hörerin an der Medizinischen Fakultät der Universität in Prag zugelassen. Trotz mehrerer Anfragen – sogar am Wiener Hof – konnte Anna Honzáková erst 1900, nach der Zulassung von Frauen zum Medizinstudium Prüfungen ablegen. Sie promovierte am 17. März 1902 als erste Ärztin und damit als zweite Frau nach Marie Zdenka Baborova an der Prager Karls-Universität.

Nach dem Studienabschluss arbeitete sie für drei Jahre in der Universitätsklinik und als Schulärztin, jedoch blieb ihr die Stelle einer Assistenzärztin verwehrt. Deshalb eröffnete sie 1905 eine Praxis in der Prager Neustadt. Anna Honzáková spezialisierte sich auf Gynäkologie und Geburtshilfe und konnte sehr schnell eine große Anzahl an Patientinnen gewinnen, von denen sie viele auch kostenlos behandelte. Sie praktizierte bis an ihr Lebensende. Anna Honzáková hat sich in ihrer Arbeit sehr stark der Gesundheitserziehung junger Frauen gewidmet und sich in den Zwanzigerjahren für die Legalisierung der Abtreibung engagiert. In den Dreißigerjahren hielt sie mehrere Vorlesungen zu Fragen des Schutzes vor ungewollten Schwangerschaften.

Sie war in der Frauenbewgeung engagiert, insbesondere im Frauenverein „Minerva“, im Výbor pro volební právo žen (Ausschuss für das Frauenwahlrecht) und im Ženský klub ceský (Tschechischen Frauenklub), dessen Mitbegründerin sie gemeinsam mit Charlotte Masaryk war. Ebenfalls mitbegründet hat Anna Honzáková den Sdružení československých lékařek (Verband tschechoslowakischer Ärztinnen) und sie wurde für ein Jahr dessen Vereinsvorsitzende. Im Jahr 1937 richtete sie den Fonds „Anny Honzákové-Hlaváčové“ für die Unterstützung armer und kranker Frauen ein. Sie hatte den Beinamen "Matka matek", zu Deutsch „die Mutter der Mütter“.

Anna Honzáková betätigte sich auch publizistisch: 1903 verfasste sie zusammen mit Klementinou Hanusovou einen Ratgeber über den Schutz von Kindern vor Tuberkulose (Jak chrániti dítě nákazy tuberkulosní) und 1937 eine Biographie über die tschechische Ärztin Anna Bayerová.