Milena Jesenská wird am 10. August 1896 in Prag geboren. Ihr Vater ist ein bekannter Zahnarzt, ihre Mutter, über deren Tätigkeiten man kaum etwas weiß, stammt aus einer bürgerlichen Familie. Milena Jesenská besucht zunächst eine Volksschule und dann das Mädchengymnasium Minerva. In ihrer Schulzeit beteiligt sie sich an einer Klassenzeitung und schreibt darin eine Geschichte unter dem Namen A. X. Nesseyová. Neben der Schule pflegt sie ihre kranke Mutter, bis diese 1913 verstirbt.

Nachdem Jesenská 1915 die Schule mit einer Matura abgeschlossen hat, beginnt sie auf Wunsch ihres Vaters Medizin zu studieren. Nach zwei Semestern wechselt sie zu Musik, beendet aber das Studium nicht. Sie verbringt viel Zeit im Literatencafé „Arco“, wo sie Ernst Polak kennenlernt. Sie geht mit ihm eine Beziehung ein, die ihr Vater strikt ablehnt. 1918 heiratet sie Ernst Polak und zieht mit ihm nach Wien. Dort hat sie Schwierigkeiten sich einzuleben; anders als in Prag bekommt sie in den Literatenkreisen wenig Anerkennung als eigenständige Person. Bekannt ist sie nurmehr als Frau von Ernst Polak. In der Wiener Kaffeehausszene trifft sie unter anderem auf die Schriftstellerin Gina Kaus.

Bei einem Besuch in Prag 1919 trifft Milena Jesenská erstmals Franz Kafka, dessen Erzählungen sie teilweise ins Tschechische übersetzt und in der Wochenzeitschrift „Kmen“ veröffentlicht. Im Zuge dessen strebt sie nach einer eigenen journalistischen Karriere und beginnt diese in den 1920er Jahren bei den Prager Zeitungen „Tribuna“ und „Národní listy“. Mit Kafka entwickelt sich eine enge Beziehung, die jedoch nur schriftlich besteht. Kafka vertraut ihr seine Tagebücher an, die sie nach seinem Tod 1924 (auf Kafkas Wunsch) an Max Brod übergibt und die 1952 als „Briefe an Milena“ veröffentlicht werden.

Jesenská ist mittlerweile in der Prager Zeitungswelt etabliert, ihre Ehe mit Polak steht kurz vor der Auflösung und somit kehrt sie 1925 nach Prag zurück. Dazwischen verbringt sie gemeinsam mit dem Schriftsteller Franz Xaver Schaffgotsch zehn Monate in Buchholz bei Dresden bei ihrer alten Freundin Alice Rühle-Gerstel und deren Mann. Zurück in Prag findet Jesenská in der tschechischen Avantgarde ein neues Zuhause. Sie ist nun verantwortliche Redakteurin der Frauenseite von „Národní listy“ und gemeinsam mit ihren Mitarbeiterinnen repräsentiert sie die neue tschechische Frauenelite. 1926 arbeitet sie außerdem für die Illustrierte „Pestrý týden“, für deren Gestaltung sie zuständig ist.

Im April 1927 heiratet sie Jaromír Krejcar und im Jahr darauf wird ihre Tochter Jana geboren. Eine Gelenksentzündung am Knie erschwert ihr das Leben und die journalistische Arbeit. Der Wiedereinstieg 1929 in die Zeitungswelt ist schwierig, Jesenská bekommt ihre alte Stelle in der Tageszeitung nicht wieder. Ihre Ehe zerbricht und wird endgültig aufgelöst, als Krejar arbeitsbedingt in die Sowjetunion geht.

Anfang der 1930er Jahre setzt sich Jesenská für die Arbeiter*innenbewegung ein und schließt sich der Kommunistischen Partei an. Nachdem sie von bürgerlichen Zeitungen abgewiesen wird, publiziert sie nun in linken und kommunistischen Blättern. 1937 bekommt sie eine feste Stelle bei der „Přítomnost", einer liberal-demokratischen Wochenzeitschrift. Sie schreibt über Flüchtlinge in tschechischen Grenzgebieten, über die politische Situation im Sudetenland und plädiert für eine Allianz der demokratischen Kräfte gegen den Vormarsch der Faschisten. Als Prag 1939 von deutschen Truppen besetzt wird, nimmt sie Verfolgte in ihre Wohnung auf und hilft ihnen bei der Flucht nach Polen. Die „Přítomnost“ wird verboten, Jesenská schließt sich einer Widerstandsgruppe an und schreibt für deren illegale Zeitung „V boj“.

Am 11. November 1939 wird Milena Jesenská verhaftet, bei einer Gerichtsverhandlung zunächst freigesprochen aber von der Gestapo trotzdem unter Schutzhaft gestellt. 1940 sieht sie im Dresdner Gefängnis zum letzten Mal ihre Tochter und ihren Vater, bevor sie in das Frauen-KZ Ravensbrück deportiert wird. Dort wird sie zur Arbeit im Krankenrevier eingeteilt und rettet durch Fälschungen von Laborergebnissen sowie Diagnosen neu angekommene Häftlinge vor dem Tod oder vor wissenschaftlichen Experimenten. Am 17. Mai 1944 stirbt Milena Jesenská an den Folgen von schweren Entzündungen und einer Nierenoperation.